Testes de campo aberto e de objeto novo

Conecte a câmera (duas para 3D) antes de calibrar; caso contrário, reinicie o software depois de conectá-la. Clique em 'Calibrate' e selecione 'Open Field or Zone Analysis'. Posicione a câmera para que a área quase preencha a altura ou a largura da imagem. A área de rastreamento é o piso da arena; em arenas divididas ou múltiplas, é todo o piso, incluindo todas as arenas; com 48 ou 96 poços, é todo o arranjo de poços (do canto superior esquerdo do poço superior esquerdo ao inferior direito do poço inferior direito). Informe o nome de usuário e depois a altura (de cima a baixo na tela) e a largura de toda a área de rastreamento. Marque a caixa black se os sujeitos forem claros e o fundo escuro; deixe desmarcada para animais escuros ou encapuzados sobre fundo claro. Clique nos cantos superior esquerdo e inferior direito e clique em 'Save (and return)'.

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Clique sempre primeiro no canto superior esquerdo e depois no inferior direito: clicar primeiro no canto de baixo inverte norte e sul no arquivo de calibração. No modo 3D, informe também a altura vertical a rastrear e clique nos cantos tanto da vista lateral (imagem de cima) quanto do piso (imagem de baixo). Em 2D, ignore o campo de altura ou informe 0. Para uma grade de caixas, clique no canto superior esquerdo da caixa superior esquerda e no inferior direito da caixa inferior direita. 'Click to calibrate with X-Y recorded video' só é necessário para rastrear um vídeo gravado, que deve mostrar a área na mesma posição da tela.

Depois de clicar em 'Open Field and NOR', deixe o seletor mostrando '2D-tracking mode', a menos que tenha comprado uma licença de rastreamento 3D e vá usar ao mesmo tempo câmeras de cima e lateral. Para usar 3D, clique nele para mudar para '3D-tracking mode'; na primeira vez, a janela de ativação pede seu código 3D. Clique de novo para voltar ao 2D. No modo 3D você ajusta os limiares z e xy e pode executar uma área de rastreamento (1x1).

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O 3D está disponível no módulo 'Open Field and NOR', incluindo a análise de zonas (não no labirinto aquático). Os dados 3D brutos (x, y, z com carimbos de tempo, até 60 Hz) ficam nos arquivos .BOND em …\Data\Open Field Test\BOND\. Se faltar a coluna Z, o ensaio foi executado em 2D: ative o 3D antes de calibrar e executar. O rastreamento 3D precisa de fundo claro. Se só houver uma câmera conectada, volte o seletor para '2D-tracking mode'. Análise: 'Z-Plot' mostra a posição vertical em função do tempo.

Disponha a câmera e a arena para que as linhas da grade de zonas da análise coincidam com os limites de interesse; para reconhecimento de objetos, monte de forma que cada objeto fique dentro de uma célula da grade. As grades de zonas (sobrepostas durante a análise e definidas pela raiz quadrada do número de zonas) são diferentes das grades de várias arenas, e você pode reanalisar com outros tamanhos de zona. Os objetos fazem parte do fundo, então, quando possível, dê a eles uma cor parecida com a do piso; em testes sociais com um animal sob um copo invertido, pinte a base do copo como o piso; mascare outros objetos contrastantes. O fundo de toda a área de rastreamento, incluindo áreas não visitadas e espaços entre arenas, deve ser branco para animais escuros ou encapuzados ou preto para animais brancos.

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Planeje a grade antes de executar: coloque os objetos no centro das zonas e mantenha a mesma posição (marque a grade temporariamente). O rastreamento do centro do corpo pontua o tempo perto dos objetos; farejadas e contatos com as patas são pontuados manualmente, ou use o Precision Tracker para a posição da cabeça em arenas pequenas. Em arenas grandes, onde o animal é pequeno em relação à célula, o rastreamento padrão funciona bem para NOR. Os objetos também podem ser mascarados por software pelo módulo Morris Water Maze (contate a HVS).

No 'Maze and Field Control Panel', clique em 'Run' (informe o código de ativação do rastreamento se for pedido). Na aba 'Maze Type', escolha 'Open Field or Zone Analysis' e o número de arenas ('Single Field', '2x2 Fields' ou '3x3 Fields') e depois abra a aba 'Tracking'. Deixe a iluminação exatamente como nos ensaios, coloque os objetos, ponha um animal em cada área e use 'Set X-Y Threshold' (e 'Set Z Threshold' em 3D) até que uma cruz verde ou vermelha acompanhe o animal aonde ele for. Use 'Set X-Y Size': à esquerda para animais pequenos em áreas grandes, à direita para animais relativamente grandes em caixas pequenas, para que o corpo, e não a cauda, seja rastreado e marcas pequenas como fezes sejam ignoradas. Se nenhuma posição do controle funcionar, melhore a iluminação e os ajustes da câmera para ter cor uniforme, bom contraste e nenhum reflexo ou sombra; depois ajuste os controles com o animal na área problemática.

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Uma cruz verde rastreia animais escuros sobre fundo claro; uma cruz vermelha rastreia animais brancos sobre fundo escuro. Se aparecer a errada, recalibre com a configuração correta de cor de fundo. Se nenhuma cruz aparecer, verifique se nem o controle do limiar nem o de tamanho estão em 0; comece com o tamanho logo acima de zero, deslize devagar o limiar para achar onde a cruz aparece e depois ajuste o tamanho à largura do corpo e faça o ajuste fino. Não é preciso desfocar o vídeo para ignorar caudas; use o controle de tamanho. Em vídeos gravados, pode ser preciso ajustar brilho e contraste se as condições não foram preparadas antes da gravação.

Você pode executar uma área de rastreamento (1x1) em 3D, ou uma ou várias (por exemplo 2x2 ou 3x3) em 2D, como ensaios individuais ou em série. Selecione o número de campos na aba 'Maze Type', abra a aba 'Configuration', informe 'Max secs' e escolha 'Single Trial' ou 'Series of Trials'. Na aba 'Run a Trial', informe Trial Name (incluído no nome de cada arquivo .hvs; com várias arenas, acrescenta-se o número da arena), User Name, Subject e Descriptor (normalmente o grupo) e um Remark opcional; Start Point pode ficar em branco. Para várias arenas, informe o ID de cada sujeito em sequência separado por barras verticais (|), e o mesmo para os descritores; o mais fácil é digitá-los num arquivo de texto e colar. Clique em 'Prepare to Run', coloque os sujeitos e clique em 'Run' quando o ensaio deve começar; 'End Trial' encerra antes; 'Return' volta ao menu.

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Não se usa início automático: clique em 'Run' ao soltar o animal, logo depois que sua mão sair da imagem da câmera, porque o início automático pode ser disparado pelas mãos. Grades como 3x3 são para um animal por subarena; para uma única arena, use 'Single Field'. Usar uma grade 3x3 para um só animal gera nove arquivos .hvs e exige um sujeito e um descritor para cada subarena. Se o nome de um sujeito for longo demais para a lista de ensaios, 'Look at HVS' mostra o nome completo do arquivo. Vários animais juntos numa mesma arena precisam de outro sistema (multianimal); contate a HVS.

Crie a lista de sujeitos e descritores na ordem de execução e salve-a com a extensão .txp em C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Config\Master Experiment Files\ (ela abre ali automaticamente, embora você possa procurar em outro lugar). No Excel, deixe as duas primeiras colunas em branco e use a terceira e a quarta para sujeito e descritor, uma linha por ensaio; para várias arenas, separe sujeitos e descritores com barras verticais, por exemplo mouse1|mouse2|mouse3|mouse4 e groupA|groupA|groupB|groupB. Salve como [nome do arquivo].txp, escolhendo CSV como tipo se 'All files' não estiver disponível. No Bloco de Notas, cada linha fica assim: ,,mouse1,groupA. Depois abra a aba 'Configuration', selecione 'Series of Trials', clique em 'Choose TXP/MEF' e escolha o arquivo; o primeiro sujeito e o primeiro grupo aparecem na aba 'Run a Trial'.

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Se o software informar que não encontra o .txp, provavelmente ele foi salvo como .txt, .csv ou .xls: salve de novo com o tipo 'All files' e a extensão .txp. Vírgulas faltando deslocam os campos (o sujeito aparece como descritor). Linhas que começam com aspas duplas são observações. Marque 'Record' para salvar quadros de vídeo (precisa de ativação própria); desmarque ao rastrear vídeos gravados. Se não encontrar 'Record' na sua versão, contate a HVS pelo botão Support ou pela página de contato.

Clique em 'Analyze' e selecione Open Field (OF and ZA). Mantenha Video Height e Width em 480 e 640 para ensaios ao vivo; para vídeos gravados, ajuste-os ao tamanho do vídeo. Clique no nome de um ensaio para ver a trajetória; para ver arenas simultâneas juntas, marque 'Retain Previous Plots' e clique em cada uma. Informe o Grid Size (linhas e colunas) e pressione Enter. Os resultados por zona começam no canto superior esquerdo e descem pela coluna mais à esquerda, depois a segunda coluna, e assim por diante. Escolha um tamanho de grade que coloque objetos ou áreas especiais dentro de uma célula ou bloco de células; os resultados então dão % de tempo, % de trajetória, entradas e latência dessas células. Ignore os botões Detection Area no campo aberto. 'Analyze Single' mostra os resultados na tela (trajetória total, duração, velocidade média, % de zonas visitadas, entradas em zonas, % de tempo por zona, congelamento/inatividade); Print ou Export salvam um arquivo de texto completo, incluindo a latência até cada zona (-1 = não visitada) e a sequência de entradas nas zonas.

Para se aprofundar

Em 5x5, a célula 5 é a inferior esquerda e a célula 6 a de cima da segunda coluna. Para totais de área interna versus externa, some no Excel as colunas de zona correspondentes. O layout de várias arenas 3x3 é separado da grade de análise (por exemplo, defina a grade de análise como 3 para dividir uma caixa de três câmaras).

O congelamento (freezing) é a imobilidade completa, exceto a respiração, e a inatividade é um critério mais frouxo de pouco movimento numa janela mais longa; o HVS Image detecta ambos com uma janela de tempo e uma distância de movimento. Use as caixas Time Window e Movement em Freezing para definir por quantos segundos o sujeito deve ficar parado e dentro de qual distância; por exemplo, congelamento como não se mover mais de 0,1 cm em 2 s, ou inatividade como não se mover mais de 5 cm em 10 s. Se nenhum for relevante, defina um Time Window grande (por exemplo 100 s) e um Movement pequeno (0,1 cm) e não inclua o congelamento nos resultados. Os resultados incluem número de episódios de congelamento, tempo congelado e % de tempo congelado.

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O software informa o tempo total real de congelamento, o % de tempo e o número de episódios; não há configuração para amostragem fixa a cada 10 s. Para câmaras de condicionamento de medo com vista lateral, use 2D com uma câmera montada no alto, na frente, mascare de preto as áreas claras dentro da câmara e ajuste a iluminação para que as barras não reflitam. Uma mancha escura na cabeça pode ajudar o rastreamento do congelamento.

Selecione um ensaio e clique em 'Setup Custom'; informe o nome do arquivo CST; marque os itens desejados na seção de cima e em 'Open Field and Zone Analysis Variables' (ignore 'Maze Variables'); clique em 'Save Spec'. No painel superior direito da tela de análise, selecione esse arquivo CST, selecione os ensaios (Ctrl+clique ou Shift com as setas) e clique em 'Auto-Analyze'; os traçados podem passar rapidamente. Clique em 'View CST' (ou clique duas vezes no nome do CST) para vê-lo. Os arquivos CST são separados por vírgulas e ficam em C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Data\Open Field Test\CST. No Excel, cada ensaio é uma linha, com uma coluna por item, e o % de tempo por zona tem uma coluna por célula na ordem padrão.

Para se aprofundar

Importação no Excel: Dados > De Texto/CSV, escolha Todos os arquivos, selecione o .cst, delimitador Vírgula, Carregar (Excel antigo: Dados > Obter Dados Externos > De Texto, delimitado, vírgula). Você pode gerar vários arquivos CST para os mesmos ensaios com tamanhos de grade ou itens diferentes. As células da grade de várias arenas aparecem da superior esquerda primeiro à inferior direita por último (em 3x3, a nona). As coordenadas da trajetória dos arquivos exportados podem ser plotadas no Excel ou em outro software de gráficos.

Se 'Record' estiver marcado, cada quadro é salvo em C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Data\[experiment type]\Videos\. O FFmpeg, o principal conversor de código aberto, é fornecido com documentação própria em C:\HVS Image 2027\Helper Apps\ffmpeg\. Salvar quadros em vez de vídeo evita que a compressão rode enquanto o próximo ensaio é rastreado, mantém cada quadro na resolução original e permite que você escolha a compressão e a taxa de quadros.

Para se aprofundar

A gravação de quadros de vídeo precisa de código de ativação próprio, separado do rastreamento e da análise. O controle de taxa de quadros vai de 0 (sem gravação) a 1000 ms entre quadros; 100 ms dá cerca de 10 quadros/s; intervalos muito curtos podem dar menos quadros conforme a velocidade do PC (máximo de cerca de um quadro a cada 0,03 s). Os quadros ocupam muito espaço em disco: tire do PC as pastas Videos antigas; o HVS Image avisa quando menos de 10% do disco está livre.

Protocolo para camundongos: 50 × 50 × 38 cm, 500-1000 lux, pelo menos 30 min de aclimatação, 10 min de teste, limpeza com etanol 95% [Seibenhener & Wooten 2015]. O tempo no centro e a tigmotaxia refletem a ansiedade [Prut & Belzung 2003].

Para se aprofundar

O nível de luz afeta muito as medidas de ansiedade do campo aberto: mantenha-o constante.