Open-Field- und Novel-Object-Tests

Schließen Sie die Kamera (zwei für 3D) vor dem Kalibrieren an, andernfalls starten Sie die Software nach dem Anschließen neu. Klicken Sie auf 'Calibrate' und wählen Sie 'Open Field or Zone Analysis'. Richten Sie die Kamera so aus, dass der Bereich Höhe oder Breite des Bildes fast ausfüllt. Der Tracking-Bereich ist der Arenaboden; bei geteilten oder mehreren Arenen der gesamte Boden einschließlich aller Arenen; bei 48 oder 96 Wells die gesamte Well-Anordnung (von der oberen linken Ecke des oberen linken Wells bis zur unteren rechten Ecke des unteren rechten Wells). Geben Sie den Benutzernamen und dann Höhe (von oben nach unten auf dem Bildschirm) und Breite des gesamten Tracking-Bereichs ein. Setzen Sie das Häkchen bei black, wenn die Tiere hell und der Hintergrund dunkel ist; für dunkle oder gescheckte Tiere auf hellem Hintergrund nicht ankreuzen. Klicken Sie die obere linke und die untere rechte Ecke an und dann 'Save (and return)'.

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Klicken Sie immer zuerst oben links und dann unten rechts: Wird zuerst die untere Ecke angeklickt, sind Nord und Süd in der Kalibrierungsdatei vertauscht. Im 3D-Modus geben Sie zusätzlich die zu trackende vertikale Höhe ein und klicken die Ecken sowohl der Seitenansicht (oberes Bild) als auch des Bodens (unteres Bild) an. In 2D das Höhenfeld ignorieren oder 0 eingeben. Bei einem Raster aus Boxen klicken Sie oben links in der oberen linken Box und unten rechts in der unteren rechten Box. 'Click to calibrate with X-Y recorded video' ist nur nötig, um ein aufgezeichnetes Video zu tracken, das den Bereich an derselben Bildschirmposition zeigen muss.

Lassen Sie nach dem Klick auf 'Open Field and NOR' den Umschalter auf '2D-tracking mode', sofern Sie keine 3D-Tracking-Lizenz erworben haben und gleichzeitig Kameras von oben und von der Seite nutzen. Für 3D darauf klicken, um zu '3D-tracking mode' zu wechseln; beim ersten Mal fragt das Aktivierungsfenster nach Ihrem 3D-Code. Erneut klicken, um zu 2D zurückzukehren. Im 3D-Modus stellen Sie z- und xy-Schwellenwerte ein und können einen Tracking-Bereich (1x1) fahren.

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3D ist im Modul 'Open Field and NOR' verfügbar, einschließlich Zonenanalyse (nicht im Wasserlabyrinth). 3D-Rohdaten (x, y, z mit Zeitstempeln, bis zu 60 Hz) liegen in den .BOND-Dateien unter …\Data\Open Field Test\BOND\. Fehlt die Z-Spalte, wurde der Durchgang in 2D gefahren: 3D vor dem Kalibrieren und Starten einstellen. 3D-Tracking braucht einen hellen Hintergrund. Ist nur eine Kamera angeschlossen, den Umschalter auf '2D-tracking mode' zurückstellen. Analyse: 'Z-Plot' zeigt die vertikale Position über die Zeit.

Richten Sie Kamera und Arena so aus, dass die Linien des Zonenrasters der Analyse mit den interessierenden Grenzen übereinstimmen; bei der Objekterkennung so, dass jedes Objekt in einer Rasterzelle liegt. Zonenraster (bei der Analyse überlagert und über die Quadratwurzel der Zonenzahl festgelegt) sind etwas anderes als Raster aus mehreren Arenen, und Sie können mit anderen Zonengrößen neu analysieren. Objekte gehören zum Hintergrund; geben Sie ihnen daher nach Möglichkeit eine ähnliche Farbe wie dem Boden; bei Sozialtests mit einem Tier unter einem umgedrehten Becher färben Sie den Becherboden wie den Boden; maskieren Sie andere kontrastierende Objekte. Der Hintergrund im gesamten Tracking-Bereich, auch in unbesuchten Bereichen und Zwischenräumen zwischen Arenen, muss für dunkle oder gescheckte Tiere weiß und für weiße Tiere schwarz sein.

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Planen Sie das Raster vor dem Start: Objekte in die Zonenmitten legen und die Platzierung konstant halten (Raster vorübergehend markieren). Tracking der Körpermitte erfasst die Zeit nahe an Objekten; Schnüffeln und Pfotenkontakte werden manuell bewertet, oder nutzen Sie in kleinen Arenen den Precision Tracker für die Kopfposition. In großen Arenen, in denen das Tier im Verhältnis zur Zelle klein ist, funktioniert Standard-Tracking für NOR gut. Objekte lassen sich auch per Software über das Modul Morris Water Maze maskieren (HVS kontaktieren).

Klicken Sie im 'Maze and Field Control Panel' auf 'Run' (geben Sie bei Aufforderung den Tracking-Aktivierungscode ein). Wählen Sie im Reiter 'Maze Type' 'Open Field or Zone Analysis' und die Anzahl der Arenen ('Single Field', '2x2 Fields' oder '3x3 Fields') und öffnen Sie dann den Reiter 'Tracking'. Stellen Sie die Beleuchtung genau wie bei den Durchgängen ein, platzieren Sie eventuelle Objekte, setzen Sie in jeden Bereich ein Tier und nutzen Sie 'Set X-Y Threshold' (und in 3D 'Set Z Threshold'), bis ein grünes oder rotes Kreuz dem Tier überallhin folgt. 'Set X-Y Size': links für kleine Tiere in großen Bereichen, rechts für relativ große Tiere in kleinen Boxen, damit der Körper und nicht der Schwanz getrackt wird und kleine Markierungen wie Kot ignoriert werden. Funktioniert keine Reglerstellung, verbessern Sie Beleuchtung und Kameraeinstellungen für gleichmäßige Farbe, guten Kontrast und keine Spiegelungen oder Schatten; justieren Sie die Regler dann mit dem Tier im Problembereich.

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Ein grünes Kreuz trackt dunkle Tiere auf hellem Hintergrund; ein rotes Kreuz trackt weiße Tiere auf dunklem Hintergrund. Erscheint das falsche, kalibrieren Sie mit der richtigen Hintergrundfarbe neu. Erscheint kein Kreuz, prüfen Sie, ob weder der Schwellenwert- noch der Größenregler auf 0 steht; beginnen Sie mit der Größe knapp über null, schieben Sie den Schwellenwert langsam, bis das Kreuz erscheint, setzen Sie dann die Größe auf Körperbreite und justieren Sie fein. Das Video muss nicht weichgezeichnet werden, um Schwänze zu ignorieren; nutzen Sie den Größenregler. Bei aufgezeichneten Videos müssen Helligkeit und Kontrast eventuell angepasst werden, wenn die Bedingungen vor der Aufnahme nicht eingerichtet waren.

Sie können einen Tracking-Bereich (1x1) in 3D oder einen oder mehrere (z. B. 2x2 oder 3x3) in 2D fahren, als Einzeldurchgänge oder als Serie. Wählen Sie im Reiter 'Maze Type' die Anzahl der Felder, öffnen Sie den Reiter 'Configuration', geben Sie 'Max secs' ein und wählen Sie 'Single Trial' oder 'Series of Trials'. Geben Sie im Reiter 'Run a Trial' Trial Name (Teil jedes .hvs-Dateinamens; bei mehreren Arenen wird die Arenanummer angehängt), User Name, Subject und Descriptor (meist die Gruppe) sowie optional einen Remark ein; Start Point kann leer bleiben. Bei mehreren Arenen jede Tier-ID nacheinander getrennt durch senkrechte Striche (|) eingeben, die Deskriptoren ebenso; am einfachsten tippen Sie sie in eine Textdatei und fügen sie ein. Klicken Sie auf 'Prepare to Run', setzen Sie die Tiere ein und klicken Sie auf 'Run', wenn der Durchgang beginnen soll; 'End Trial' beendet vorzeitig; 'Return' führt zurück ins Menü.

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Ein automatischer Start wird nicht verwendet: Klicken Sie beim Loslassen des Tieres auf 'Run', kurz nachdem Ihre Hand das Kamerabild verlassen hat, denn ein Autostart kann durch Hände ausgelöst werden. Raster wie 3x3 sind für ein Tier pro Teilarena gedacht; für eine einzelne Arena 'Single Field' verwenden. Ein 3x3-Raster für ein einzelnes Tier erzeugt neun .hvs-Dateien und erfordert für jede Teilarena ein Tier und einen Deskriptor. Ist ein Tiername für die Durchgangsliste zu lang, zeigt 'Look at HVS' den vollständigen Dateinamen. Mehrere Tiere zusammen in einer Arena brauchen ein anderes (Mehrtier-)System; wenden Sie sich an HVS.

Erstellen Sie die Liste der Tiere und Deskriptoren in Durchlaufreihenfolge und speichern Sie sie mit der Endung .txp in C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Config\Master Experiment Files\ (dort öffnet sie sich automatisch, Sie können aber auch woanders suchen). In Excel die ersten beiden Spalten leer lassen und die dritte und vierte für Tier und Deskriptor verwenden, eine Zeile pro Durchgang; bei mehreren Arenen Tiere und Deskriptoren mit senkrechten Strichen trennen, z. B. mouse1|mouse2|mouse3|mouse4 und groupA|groupA|groupB|groupB. Als [Dateiname].txp speichern und CSV als Typ wählen, falls 'All files' nicht verfügbar ist. Im Editor lautet jede Zeile ,,mouse1,groupA. Öffnen Sie dann den Reiter 'Configuration', wählen Sie 'Series of Trials', klicken Sie auf 'Choose TXP/MEF' und wählen Sie die Datei; das erste Tier und die erste Gruppe erscheinen im Reiter 'Run a Trial'.

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Meldet die Software, dass die .txp nicht gefunden wird, wurde sie wahrscheinlich als .txt, .csv oder .xls gespeichert: erneut mit Dateityp 'All files' und der Endung .txp speichern. Fehlende Kommas verschieben Felder (das Tier erscheint als Deskriptor). Zeilen, die mit einem doppelten Anführungszeichen beginnen, sind Anmerkungen. 'Record' ankreuzen, um Videobilder zu speichern (braucht eine eigene Aktivierung); beim Tracking aufgezeichneter Videos das Häkchen entfernen. Finden Sie 'Record' in Ihrer Version nicht, wenden Sie sich über die Schaltfläche Support oder die Kontaktseite an HVS.

Klicken Sie auf 'Analyze' und wählen Sie Open Field (OF and ZA). Lassen Sie Video Height und Width für Live-Durchgänge auf 480 und 640; bei aufgezeichneten Videos auf die Videogröße einstellen. Klicken Sie auf einen Durchgangsnamen, um seinen Pfad zu sehen; um gleichzeitige Arenen zusammen zu sehen, 'Retain Previous Plots' ankreuzen und jede anklicken. Geben Sie die Grid Size (Zeilen und Spalten) ein und drücken Sie die Eingabetaste. Zonenergebnisse beginnen oben links und laufen die linke Spalte hinunter, dann die zweite Spalte und so weiter. Wählen Sie eine Rastergröße, bei der Objekte oder besondere Bereiche in einer Zelle oder einem Zellblock liegen; die Ergebnisse liefern dann Zeitanteil, Weganteil, Eintritte und Latenz für diese Zellen. Die Detection-Area-Schaltflächen im Open Field ignorieren. 'Analyze Single' zeigt Ergebnisse auf dem Bildschirm (Gesamtweg, Dauer, Durchschnittsgeschwindigkeit, Anteil besuchter Zonen, Zoneneintritte, Zeitanteil pro Zone, Freezing/Inaktivität); Print oder Export speichern eine vollständige Textdatei, einschließlich Latenz bis zu jeder Zone (-1 = nicht besucht) und der Abfolge der Zoneneintritte.

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Bei 5x5 ist Zelle 5 unten links und Zelle 6 oben in der zweiten Spalte. Für Summen innen gegenüber außen addieren Sie in Excel die entsprechenden Zonenspalten. Das 3x3-Layout mit mehreren Arenen ist unabhängig vom Analyseraster (setzen Sie z. B. das Analyseraster auf 3, um eine Drei-Kammer-Box aufzuteilen).

Freezing ist völlige Bewegungslosigkeit bis auf die Atmung, Inaktivität ein lockereres Kriterium mit wenig Bewegung über ein längeres Fenster; HVS Image erkennt beides über ein Zeitfenster und eine Bewegungsstrecke. Legen Sie mit den Feldern Time Window und Movement unter Freezing fest, wie viele Sekunden das Tier stillhalten muss und innerhalb welcher Strecke; z. B. Freezing als Bewegung von höchstens 0,1 cm in 2 s oder Inaktivität als höchstens 5 cm in 10 s. Ist beides nicht relevant, ein großes Time Window (z. B. 100 s) und eine kleine Movement (0,1 cm) einstellen und Freezing nicht in die Ergebnisse aufnehmen. Die Ergebnisse umfassen Anzahl der Freezing-Episoden, Freezing-Zeit und Zeitanteil im Freezing.

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Die Software gibt die tatsächliche Freezing-Gesamtzeit, den Zeitanteil und die Anzahl der Episoden aus; eine Einstellung für feste 10-s-Zeitstichproben gibt es nicht. Für Angstkonditionierungskammern mit Seitenansicht verwenden Sie 2D mit einer hoch vorne montierten Kamera, maskieren helle Bereiche in der Kammer schwarz und stellen die Beleuchtung so ein, dass die Gitterstäbe nicht spiegeln. Ein dunkler Fleck auf dem Kopf kann das Tracking beim Freezing erleichtern.

Wählen Sie einen Durchgang und klicken Sie auf 'Setup Custom'; geben Sie den CST-Dateinamen ein; kreuzen Sie die gewünschten Elemente im oberen Abschnitt und unter 'Open Field and Zone Analysis Variables' an ('Maze Variables' ignorieren); klicken Sie auf 'Save Spec'. Wählen Sie im oberen rechten Bereich des Analysebildschirms diese CST-Datei, wählen Sie die Durchgänge (Strg-Klick oder Umschalt mit Pfeiltasten) und klicken Sie auf 'Auto-Analyze'; die Pfade können kurz vorbeihuschen. Klicken Sie auf 'View CST' (oder doppelt auf den CST-Namen), um sie anzusehen. CST-Dateien sind kommagetrennt und liegen in C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Data\Open Field Test\CST. In Excel ist jeder Durchgang eine Zeile mit einer Spalte pro Element, und der Zeitanteil pro Zone hat eine Spalte pro Zelle in der Standardreihenfolge.

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Excel-Import: Daten > Aus Text/CSV, Alle Dateien wählen, die .cst auswählen, Trennzeichen Komma, Laden (ältere Excel-Versionen: Daten > Externe Daten abrufen > Aus Text, getrennt, Komma). Sie können für dieselben Durchgänge mehrere CST-Dateien mit unterschiedlichen Rastergrößen oder Elementen erstellen. Rasterzellen mehrerer Arenen erscheinen von oben links zuerst bis unten rechts zuletzt (bei 3x3 die neunte). Pfadkoordinaten aus exportierten Dateien lassen sich in Excel oder anderer Grafiksoftware darstellen.

Ist 'Record' angekreuzt, wird jedes Bild in C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Data\[experiment type]\Videos\ gespeichert. FFmpeg, der führende Open-Source-Konverter, wird mit eigener Dokumentation in C:\HVS Image 2027\Helper Apps\ffmpeg\ mitgeliefert. Bilder statt Video zu speichern verhindert, dass die Kompression läuft, während der nächste Durchgang getrackt wird, erhält jedes Bild in Originalauflösung und lässt Sie Kompression und Bildrate selbst wählen.

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Die Videobildaufzeichnung braucht einen eigenen Aktivierungscode, getrennt von Tracking und Analyse. Der Bildratenregler reicht von 0 (keine Aufzeichnung) bis 1000 ms zwischen den Bildern; 100 ms ergeben etwa 10 Bilder/s; sehr kurze Intervalle können je nach PC-Geschwindigkeit weniger Bilder liefern (maximal etwa ein Bild pro 0,03 s). Bilder belegen viel Speicherplatz: Alte Videos-Ordner vom PC verschieben; HVS Image warnt, wenn weniger als 10% des Datenträgers frei sind.

Mausprotokoll: 50 × 50 × 38 cm, 500-1000 Lux, mindestens 30 min Eingewöhnung, 10 min Test, Reinigung mit 95% Ethanol [Seibenhener & Wooten 2015]. Zeit im Zentrum und Thigmotaxis spiegeln Ängstlichkeit wider [Prut & Belzung 2003].

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Die Lichtstärke beeinflusst Angstmessgrößen im Open Field stark: Halten Sie sie konstant.